对江西三清山黄杉林区耐性孢子与花旗松 Pseudotsuga menziesii形成的菌根进行了研究，通过分析形成的菌根真菌种类、幼苗生物量以及土壤理化性质，研究了菌根数量、侵染率、不同种类对幼苗生长以及土壤微环境对菌根群落结构形成的影响。结果 表明：外生菌根真菌的侵染可以有效促进宿主植物的生长，尤其是在两种菌种共存的情况下 (地上： y=-0.010x2+0.042x+0.047，R2= 0.308，P＜ 0.001；地下： y=-0.007x2+0.032x+0.048， R2= 0.225，P＜ 0.001)，其中菌种 Meliniomyces spp. 和 Rhizopogon spp.对幼苗生长影响最为明显；菌根的侵染率与幼苗地上部生物量存在正相关性 (y=0.054+0.145x，R2=0.404，P＜ 0.001)；在孢子群落中占优势地位，与宿主特异性共生，同时有效地促进宿主幼苗生长的菌种 Rhizopogon spp.，可能是在黄杉林业重建中具有应用前景的菌根真菌；在所测定土壤因子中， K、OM、Cond以及 pH值是影响菌根群落的主要因素。该研究结果为利用菌根技术进行林业重建提供了理论依据。

Pseudotsuga menziesii seedlings were used to clarify the ectomycorrhizal (ECM) symbiosis formed by tolerance spores in soils collected from Sanqing Mountain, Jiangxi province. ECM species, inoculation rate, dry weight of seedlings and soil properties were tested in this study. Besides, the effects of ECM fungal number, inoculation rates and species in seedlings growth were analyzed. The results showed that inoculation with ECM fungi significantly improved the growth of seedlings, especially coexistence with 2 species (Shoots: y = -0.010x2 + 0.042x + 0.047, R2= 0.308, P＜ 0.001 and Roots: y = -0.007x2 + 0.032x + 0.048, R2= 0.225, P＜ 0.001). The effects of Meliniomyces spp. and Rhizopogon spp. on the growth of seedlings were significantly. And there was a positive correlation between mycorrhizal colonization rates and shoots dry weight (y=0.054+0.145x, R2=0.404, P＜ 0.001). Dominance of Rhizopogon spp. in spore banks, potentially growth-promoting effects, and host specificity make it a promising ECM fungus, which could facilitate seedling establishment and its forest regeneration of the endangered Chinese Douglas-fir. Among the soil parameters we tested, K, OM, Cond and pH were the main factors affecting the mycorrhizal community. The results provided a theoretical basis for forestation by using mycorrhizal technology.

黄杉属 Pseudotsuga 现仅存不足 10个种 ^[1-3]，以花旗松 Pseudotsuga menziesii为模式种，依据地理分布可分为美洲组 Americanae group和亚洲组 Asiaticae group，间断分布于东亚和北美西部。黄杉属在中国主要有 5个种，均为特有种 ^[1]，隶属国家Ⅱ级保护濒危树种，主要分布于我国秦岭以南的亚热带山区：湖南、湖北、云南、贵州、安徽、江西、广西、福建和台湾，其中短叶黄杉P. brevifolia为黄杉属在我国分布最南的物种。中国黄杉依据种类的不同，表现出垂直分布特性：东部的华东黄杉 P. gaussenii、台湾黄杉 P. wilsoniana、黄杉 P. sinensis和最西部的澜沧黄杉 P. forrestii^[4]，由于各种原因在不断地减少，甚至灭绝，其中，外生菌根系统的改变是导致濒危树种枯萎、濒临死亡的重要原因之一。

外生菌根（ ECM），作为土壤真菌与宿主植株形成的互惠共生体结构，是树木生存、生长过程中所必须的 ^[5]，真菌从土壤中获得氮源以提供宿主，满足其生长需求。在生态环境中，宿主的一些生理生态变化有时会由与其共生的 ECM真菌所决定。形成 ECM除了菌丝体以外，土壤孢子也是一个重要因素。作为真菌赖以繁殖的孢子库，可以在土壤中保持繁殖能力长达几年，数十年，甚至更长 ^[6]，是陆地生态系统的重要组成部分 ^[7]。土壤孢子，在外界因素：如火灾、飓风、砍伐 ^[8-9]，甚至一些根类分泌的刺激信号 ^[10]（如黄酮类化学物质等）的刺激下，与宿主植株重新形成 ECM。外源树种引种时，与其共生的先锋菌种，往往起着关键作用，它们量大、分布广泛且易与引种树木形成 ECM，可以很好地改善宿主耐性，提高其适应新环境的能力 ^[11-12]。

亲缘关系比较近的树种易形成相似的菌根群落结构，同时华东黄杉种子资源稀缺，基于这两点，在本实验设计中，以黄杉属模式树种花旗松代替华东黄杉进行孢子回接实验，同时对成功形成 ECM结构的真菌进行了鉴定。初步分析花旗松与土壤耐性孢子形成的 ECM群落结构，研究 ECM的形成在宿主生长中所起的作用。这样的研究成果，可以让人更好地了解先锋菌种以及特异性共生真菌在黄杉幼苗定植、生长中表现出来的作用，同时为保护濒危黄杉，防止森林植被的衰退提供一定的理论依据。

• 1.1 土壤样品的采集

  • 1.1.1 采样点

    三清山是江西省国家 4A级风景名胜区，位于江西北部（ 28°56′ N，118°04′ E），属亚热带湿润性季风气候。三清山的植被具有明显的垂直分带现象 , 从低海拔到高海拔依次分布有常绿阔叶林、常绿针叶阔叶混交林、常绿针叶林、高山矮灌丛。国家重点保护植物的华东黄杉林区以杜鹃花科 Ericaceae、松科 Pinaceae、山茶科 Theaceae、壳斗科 Fagaceae、蔷薇科 Rosaceae、樟科 Lamraceae和冬青科 Aquifoliaceae等种类为主 ^[13]。

  • 1.1.2 土壤样品的采集

    选取研究的树种——黄杉， GPS定位，在距离根部约 1 m处，小心除去表面腐叶等杂物，采集土壤样品（5 cm×5 cm×10 cm，长×宽×深度），置于自封袋中。同时，对周边优势树种进行统计。每隔至少 10 m，选取另一个样点，共采集土壤样品 25个。去除腐叶、根等杂质，将土样自然风干，以获得一定耐性的孢子 ^[6,14]。

• 1.2 土壤理化性质分析

  测定上述采集土壤的 pH值、电导率（ Cond）、阳离子交换（ CEC）、有机质（ OM）、全磷（ p）、全钾（ K）以及全氮（ N），测定方法参见鲍士旦（1999）《土壤农化分析》。

• 1.3 幼苗准备

  挑选饱满的花旗松种子，用 30%的 H₂O₂表面消毒 20 min，再用去离子水冲洗，在湿润的干净纱布上室温萌发。取 50 mL离心管，在底部和侧面同时开小洞，便于通气和多余水分的流出，底部塞脱脂棉，保持一定水分。加入灭菌基质（121 ℃，2 h，土∶沙∶蛭石 =1 ∶ 1 ∶ 1），在离心管土样上移种萌发露白的花旗松种子，每管 2粒。至于阳光房中培育，自然光照，温控 25 ℃ /20 ℃（早 /晚）。适时淋浇去离子水，以保持一定的湿度（ 65%±10%相对空气湿度）。 30 d后间苗，保留一株生长良好的花旗松幼苗。

• 1.4 孢子液接种

  取风干土样，加入无菌去离子水，充分震荡后，取孢子悬浮液，淋浇于幼苗根部土壤。阳光房中继续培养，以便耐性孢子形成 ECM体系。

• 1.5 样品收集

  育苗回接 8个月后，收苗。小心地将土壤与幼苗分开（尽量保证根系的完整性）。根系用流水冲洗干净，小心收集，用于 ECM样品的收集与统计。体式显微镜下，根据形态学特征，挑取不同形态的新鲜的 ECM根尖样，每种形态 3个重复（不足，则全部取出）。 ECM样品置于含有 100 µL 2×CTAB 缓冲液的 PCR离心管中，-30 ℃保存备用。幼苗分地上与地下两部分，烘干（ 80 ℃， 72 h），称重。

• 1.6 分子鉴定

  采用 CTAB法 ^[15]提取 ECM样品的 DNA，引物对 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行 PCR扩增，扩增产物直接测序，结果经过 ATGC（GENETYX Corp., Tokyo, Japan）人工核对后提交 GenBank。

• 1.7 数据分析

  对菌种的频度（ ECM真菌出现的土样数）进行统计。利用频度数据，在 EstimateS 9.1（http:// viceroy.eeb.uconn.edu/EstimateS）中进行 Chao2和 Jackknife2 （Jack2）评估，确定能与花旗松形成 ECM结构的土壤耐性孢子种类。同时，利用 SPSS 22.0 （IBM, Armonk, NY, USA），通过单因素方差分析（ ANOVA），检测不同菌种（主要的几种）和侵染菌种数目对宿主生长的影响（ LSD， P＜ 0.05）, 采用冗余分析（ Redundancy Analysis, RDA）（PC-ORD ver. 6）^[16]方法，研究主要土壤理化性质对耐性孢子形成 ECM群落结构的影响。

• 2.1 土壤理化性质

  采集土样基本理化性质如表1所示，土壤呈酸性。

  

  表1 三清山采集土壤主要理化性质
  Table 1 Chemical characteristics of soils collected from Sanqing mountain

• 2.2 菌种的统计

  通过形态学特征，共获得 ECM样品 115 个，经过 ITS序列的 PCR扩增，RFLP检验及序列测定，共获得有效序列 71个，菌种 9种（见表2）。其中，最常见的菌种为须腹菌属的一个种（Rhizopogon spp.），占鉴定序列的 71.8%，与 21株幼苗形成 ECM。其次为 Meliniomyces spp.1和 Tomentella spp.，都达到了7.0%。而其余菌种都小于5%（见表1）。实验用 25株花旗松幼苗中， 22株（88.0%）幼苗成功地与孢子形成 ECM体系，单一幼苗（即单一土壤样品）中可以形成 1到 3种 ECM，但主要集中在形成 1到 2种上，占形成 ECM苗的 86.4%。

  Chao2 （±SD）和 Jack2 （±SD）评估结果显示在所采集土样中，形成 ECM的菌种数可以达到（11±4）或是（ 15±2）种，菌种累积曲线在所采集的最大土壤样品数处，趋于平稳（见图1）。

• 2.3 菌种数量、种类对宿主生物量的影响

  ECM的侵染可以促进宿主植物的生长，并且ECM种类与宿主植物生物量统计分析可以看出，植物根部的菌种数量与植物的生物量（干重）存在一定相关性（地上： y=-0.010x²+0.042x+0.047， R²=0.308，P＜ 0.001；地下： y=-0.007x²+0.032x + 0.048，R²= 0.225，P＜ 0.001）。ECM，尤其是两种 ECM的存在，可以有效促进宿主植物花旗松幼苗的生长（见图2 ）。

  

  表2 温室培养中与花旗松幼苗共生菌根真菌的rDNA ITS序列BLAST的结果和物种的确定†
  Table 2 Summary of ITS rDNA BLAST results and species determinations for sequences of ectomycorrhizal fungi identified on P. menziesii seedlings in glasshouse experiment

  

  图1 外生菌根（ECM）真菌评估种类及种类累计曲线
  Fig.1 Minimum species richness estimates and species accumulation curves of ectomycorrhzal (ECM) fungi

• 2.4 侵染率对幼苗的生长的影响

  ECM的侵染，促进了幼苗的生长，其侵染率和花旗松幼苗的生物量（地上、地下部分干重）成正相关（ y=0.054+0.145x，R²=0.404，P＜ 0.001；y=0.058+0.097x，R²=0.188，P＜ 0.001），尤其是地上部，相关性显著。

• 2.5 主要菌种种类对宿主生物量的影响

  与未成功侵染的幼苗比， ECM的存在显著提高了花旗松幼苗生物量，对于主要菌种，幼苗之间的地上部生物量、株高均存在显著性差异（见图4）。其中， Meliniomyces和 Rhizopogon对幼苗生长影响最为显著。

• 2.6 土壤理化性质对耐性孢子群落结构的影响

  RDA分析显示两个坐标轴的解释量分别只有19.3%和 16.0%（见图5）。箭头线代表土壤理化性质（土壤因子），其长度表示某一土壤因子对菌种群落的影响大小。可见，在所测定土壤因子中，K、OM、Cond以及 pH是影响 ECM群落的主要因素。箭头线与排序轴之间的夹角反应了某一土壤理化性质与排序轴之间的相关性大小， K（r=0.521）、 pH（r=0.469）与 Axis2显著性相关， K（r=-0.430）、OM（r=-0.503）与 Axis1显著性相关。

  

  图2 侵染菌根种类与宿主生物量（A.地上部分；B.地下部分）相关性分析
  Fig.2 Linear regression to relate ectomycorrhizal colonizer richness to seedling biomass (A. Shoots; B. Roots)

  

  图3 菌根侵染率与幼苗生物量 (A.地上部分；B.地下部分 )相关性分析
  Fig.3 Line correlation between mycorrhizal colonization rates and seedlings dry weight(A. Shoots; B. Roots)

  

  图4 主要菌根真菌种类对幼苗 (A.地上部分；B.地下部分 )生长的影响
  Fig.4 The effects of major ectomycorrhizal species on the growth (A. Shoots; B. Roots) of seedlings

  

  图5 土壤理化性质与 ECM真菌 RDA排序
  Fig.5 Redundancy Analysis (RDA) ordination of soil parameters and ectomycorrhizal fungal species

华东黄杉是黄杉属在中国的一个特有濒危树种。而 ECM结构体系的缺失可能是导致其枯萎、死亡的重要原因之一。然而，目前尚缺少中国黄杉林区土壤孢子库直接的研究报道，于是，在本实验研究中，利用了三清山黄杉林区采集的土壤，进行耐性孢子回接，以期了解濒危物种林区耐性孢子形成 ECM结构情况，掌握 ECM在宿主定植生长中起到的关键作用。

结果表明，温室环境下，形成 ECM结构的菌种累积曲线在最大土壤样品数处趋于平稳，达到渐近线，甚至有向下的趋势，可见，本孢子回接实验获得的耐性孢子形成的 ECM结构，基本可以反应土壤中所存在能与宿主形成 ECM的耐性孢子群落。从 ECM群落结构可见，少数菌种占有绝对优势，而大多数菌种相对稀少，尤其是先锋菌种（如： Rhizopogon spp.）最易与宿主幼苗形成共生结构，并占有绝对优势。在与黄杉属共生的菌根真菌的研究中，不仅在北美发现了 Pseudotsuga-R. subg. Villosuli^[17-18]这种特异性共生的结构，同时，在亚洲的日本黄杉、中国华东黄杉中，也发现了与其特异性共生的 Rhizopogon菌种 [15, 19-20]。作为黄杉特异性共生的菌种 Rhizopogon spp.，在成熟的黄杉林区相对少见^[15,20]，但在本孢子回接实验中，却是优势菌种（占鉴定序列的 71.8%），可见，此菌种基本是以耐性孢子形式存在于土壤中，等待外部刺激来与宿主形成 ECM^[21-22]。先锋 ECM真菌对宿主根系有较好地响应 ^[23]，易形成 ECM体系，如： Rhizopogon、Laccaria、Hebeloma和 Inocybe等 ^[24]，会以耐性孢子体的形式存在，等待外部的刺激来获得与宿主幼苗形成 ECM^[25-26]的机会。

Rhizopogon spp.在孢子群落中占优势地位，与宿主特异性共生，同时有效地促进宿主植物的生长。可见，在黄杉幼苗定植以及生长中， Rhizopogon spp.似乎是起到关键性作用的 ECM真菌。笔者猜想，每一种濒危树种可能与一些特有的 ECM真菌共生，并依赖于它们生存。尽管如此，仍没有充分的证据表明 Rhizopogon菌种在黄杉林区的丰富度与稳定其生态系统、促进其定植生长之间存在某种特定关系。保护濒危物种，对维持生物多样性极其重要，它们往往建立了一个独特的森林生态系统，并维持着与其相关的物种多样性。

大量研究 [5,27-30]表明，菌根真菌的侵染，可以有效地促进宿主植物的生长。 ECM真菌是很多森林树种赖以定植、生存和生长的必要因素，与宿主之间互利共生： ECM真菌从宿主植物中获得 C源，作为反馈，真菌为宿主提供 N等矿质营养元素 ^[5,29]。Kaewgrajang等 ^[31]的研究发现， ECM真菌的侵染率和龙脑香幼苗的生物量（干重）成显著正相关。基于现有的研究结果同样显示， ECM真菌的侵染率、种类以及菌种数量，均对宿主植物花旗松幼苗的生长产生影响（参见结果部分）。显然，为了更好地了解 ECM体系在生理学以及生态学方面可能表现出来的作用，就有必要深入探究 ECM群落对宿主生长的作用机制。

ECM真菌群落结构很大程度上受到一些特定生物因素的影响，如：菌种本身的分布，孢子密度等 ^[32]。此外，一些非生物因素，如土壤（土壤理化性质等）等也影响 ^[33]，或者说控制着某一地区的真菌群落 ^[34]。本研究 RDA分析结果显示： OM、K、Cond以及 pH值对 ECM群落结构的形成存在显著影响。但 Axis1和 2的因素解释量仅 35.3%（分别为 19.3%和 16.0%，图5），可见还有其它一些未被测定的土壤理化性质，如：重金属 [35-36 ]等，土壤的质地 ^[37]或其他非可控因素对 ECM群落结构的形成同样起着重要作用。其次，一些生物因素，比如，群体之间的相互作用：真菌之间^[38]、真菌与其他微生物之间 ^[39]、植物之间 ^[40]等，同样影响着耐性孢子形成的 ECM群落结构。

由于 ECM群落结构特性，可以被用来作为城市环境中植物的健康状况评估的指标。因此，在后续的研究工作中，有必要加深土壤理化性质、生物等环境因素共同作用对 ECM群落结构影响机制的深入探讨，这对掌握林区 ECM群落以及 ECM在生态系统中表现出来的作用至关重要，是保护菌根生态系统的重要环节。同时，加强微生物技术的利用，筛选出有利菌种资源（细菌 ^[41]、丛枝 ^[28-29]与外生菌根真菌 [5,15,31]），人为地控制某些可控因素，为菌根化提供更好的生存环境，可以更好地应用于濒危树种的保护与林业重建，改善生态环境。