《中南林业科技大学学报》

2012年02期

抗逆模式灌木沙冬青的研究进展

张党权 1a,b,c，宋志丹 1a,b,c，田晔林 2，韩欣 1b,c，谷振军 1a,b,c

1a.长沙市经济林工程技术研究中心； 1b.林业生物技术湖南省重点实验室； 1c.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南长沙 410004；2.北京农学院园林学院，北京 102206

沙冬青;综述;抗逆性;模式灌木;荒漠地区

Research progress of adverse-resistant model shrub: Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.)

ZHANG Dang-quan1 a,b,c, SONG Zhi-dan1 a,b,c, TIAN Ye-lin2, HAN Xin1b,c, GU Zheng-jun1 a,b,c

1a. Non-wood Engineering Institute of Changsha, 1b. Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology, 1c. Key Lab. of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration, Changsha 410004, Hunan, China; 2. School of Landscape Architecture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.); review; stress resistance; model shrub; desert region

收稿日期： 2011-10-13
基金项目：国家自然科学基金项目 (30972343，31172257)
作者简介：张党权 (1976－)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为植物分子生物学与林产品加工利用； E-mail：zhangdangquan @163.com

  • 沙冬青是我国西北特有的高抗逆性灌木，是第三代古地中海沿岸植物中幸存的残遗物种，为我国荒漠地区唯一的超旱生常绿阔叶灌木树种，集抗旱、抗高温、抗冻、耐盐碱、耐腐蚀等多种抗逆性于一身，在林木抗逆性研究领域具有极其重要的科研价值。本文重点从抗冻性、遗传多样性、分子遗传学、提取物这些方面分析了沙冬青的研究特色，探讨了建立沙冬青抗逆模式灌木的潜力及应用。

    As one of the surviving plants of third generation of ancient Mediterranean coast, Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) is a high stress resistance shrub endemic in northwest area of China and is the only super-dry evergreen broadleaf shrub in the desert of China, which integrates with poly drought resisting, high temperature resisting, antifreeze, alkali resistance, corrosion resistance and other resistance in one that have very important scientific research value. The research characteristics of A. mongolicus in aspects of its frost resistance, genetic diversity, molecular genetics and tree body extract were analyzed, and the potentiality and application prospects of developing an A. mongolicus adverse-resistant model shrub in the future were discussed.

  • 引言

    沙冬青Ammopiptanthus 为豆科沙冬青属常绿阔叶灌木，仅有两种， 即蒙古沙冬青A.monggolicus 和新疆沙冬青(A. nanus，又名矮沙冬青或小沙冬青)。沙冬青是第三代古地中海沿岸的植物，在古地中海退缩、气候旱化过程中幸存的残遗物种之一，是古老的第三纪残遗种，现已列为国家二级濒危保护植物。沙冬青因抗旱能力强，对高温、严寒、霜冻、风蚀沙埋具有特殊的忍耐力，因此适生于固定沙地、沙质和石质山坡网，成为荒漠区惟一分布的常绿阔叶灌木，能有效防风固沙，是目前人类用于改造荒漠的优良灌木。沙冬青因其超强的抗逆性而受生物学家的长期研究关注，从结构特性、抗逆生理、调节物质的研究，到抗逆蛋白、基因的克隆、鉴定及功能分析均有涉及。沙冬青也是少有的中药药材，《中华草本》中记录沙冬青嫩枝和叶中所含生物碱可入药，主治冻疮，慢性风湿性关节痛，具有祛风除湿、舒筋散瘀等功效。近年对沙冬青的化学成份及其药性研究也逐渐受到关注。另外，沙冬青植株较矮、叶片肥厚、四季常青、春季开花，即可丛生为绿篱，又可单株配景，因此研究沙冬青的习性、增殖特性、品种优化改良，还能进一步开发其观赏价值。

  • 1 沙冬青的抗逆特性

    沙冬青属多浆旱生植物，其根、茎、叶演化成旱生结构，通过这些特有的结构实现抗旱、抗脱水、提高水分的利用，以忍耐大气干旱。除了超旱生结构，沙冬青体内的可溶性糖、游离氨基酸 (如脯氨酸、天冬门氨酸等 )、保护酶等系统在抗旱方面也发挥了一定的作用 [1]。ZHAO Chang­Ming等还发现，在正常条件下沙冬青叶片依赖于叶黄素循环的热耗散机制防御光的破坏，而在干旱胁迫下则还要再启用 PSⅡ反应中心的可逆反应机制以提高沙冬青的抗旱性能 [2]。

    沙冬青的耐热性在 40~45℃之间，在这个温度区间光合反应正常，直到 50℃才出现高温胁迫状况：高温使光合反应中的电子传递受阻，引起反应中心的活性下降，但即使在 50℃时光合反应中心也没有被破坏，且在胁迫解除后还可恢复其原有活性，这说明沙冬青具有极强的耐热性 [3]。

    沙冬青幼苗的单盐胁迫耐受性较强，在 0.7%以下均可正常生长，但复盐胁迫耐受性较差，浓度为 0.6%时死亡率就达到了 93.3%。适量磷肥可以明显提高沙冬青幼苗对单盐的耐受性 [4]，一定浓度的水杨酸也可有效缓解盐胁迫对沙冬青幼苗的伤害，但当水杨酸浓度达到 2.0 mmol/L时则起到相反作用。沙冬青体内的内源激素 (如 IAA、 GA3等 )会随着盐浓度的变化而变化以适应适应盐胁迫 [5]，这都说明沙冬青的耐盐性很强。

    沙冬青茎干萌芽能力强、生命力旺盛，能有效防御风蚀、沙打的损伤，发达的根系也是沙冬青抗蚀性的主要条件。沙冬青根系深，根茎长之比极大，不但能有效抗风蚀，而且能从深沙层吸收水分和养分供地上部分蒸腾与生长发育需要。沙冬青主根粗，根系与茎基部连接处也很粗，可抵御沙地昼夜大温差、减轻沙粒对根的机械损伤起到保护根的作用。另外，沙冬青根部有根瘤菌，内生根菌即能固定空气中的氮为主体提供养分，又可以有效抗碱蚀 [6]。

    沙冬青种子时期抗虫性不高，不过成株抗虫性很好。蒙古沙冬青种子受虫害不多，但新疆沙冬青种子成熟前受虫害严重，平均虫蛀率达 33%。待沙冬青长成成株时期，其叶和嫩枝中含有生物碱，性温有毒 (甚至可作杀虫剂用 )，因此沙冬青的枝叶很少受虫子及牲畜的啃食 [6]，因此在荒漠中能以常绿植物形式得以保存。

  • 2 沙冬青的抗冻分子生物学研究

    • 2.1 抗冻生理机制

      在冬季，沙冬青叶肉细胞的线粒体含量比其他季节丰富，且多分布在叶绿体出芽及分裂处和液泡周围，内质网附近也有，有时甚至被内质网不同程度的包围。沙冬青叶肉细胞中的线粒体为椭圆形、被膜清晰完整、嵴丰富、基质电子度较高。严寒环境中，与其他抗寒性一般的植物相比，沙冬青叶肉细胞的绝大部分线粒体形态仍保持正常，未有肿胀变圆、被膜断裂或嵴明显减少的现象，说明沙冬青线粒体对低温非常稳定，具有高度的抗寒性 [7]。另外，韩善华等用透射电镜观察到在冬季沙冬青叶肉细胞的中央液泡中有一种电子密度很高的内含物，它只大量出现在冬季的沙冬青叶肉细胞中，说明它的出现可能与增强沙冬青的抗冻性有关。

      周宜君、刘春等认为沙冬青的超旱生结构也是其抗严寒的主要方式之一，其根、茎、叶中存在着抗冻蛋白及脯氨酸在抗冻时也起了重要的作用 [1]。除了形态、生理上的抗冻习性外，近年来发现沙冬青的强抗冻性能还与低温诱导基因和抗冻蛋白基因有直接的关系。

    • 2.2 低温诱导基因

      目前研究低温诱导基因方法主要有三种：一是现代分子生物学技术，包括基因芯片技术、 DNA标签法、差别筛选法等直接分离、驯化相关的基因；二是传统或正向、反向遗传学方法，包括 T-DNA的定向插入、反义 RNA和共抑制技术以及基因沉默技术，筛选并研究大量突变群体中的低温胁迫基因作用位点和功能；三是分子探针分析，如 CAPS、RFLP和 QTL谱，确定低温诱导基因遗传图 [8]。

      Liu M等克隆到经冷冻胁迫诱导的沙冬青 cDNA，对比后发现了两个新序列 [9]，其他 9个均能在 GenBank中找到同源序列，其中 AmCIP基因经序列分析和蛋白质功能鉴定后被认为可以保护细胞膜结构的稳定以提高低温耐受性。宋健以 cDNA-AFLP的方法克隆得到在沙冬青体内冬季上调表达的肌醇半乳糖苷合成酶基因 ( AmGolS)， AmGolS不仅受到冷冻胁迫的诱导，其上游调控序列还有多种冷冻胁迫诱导相关转录因子的顺式作用元件。宋健又将 AmGolS基因分别转化到大肠杆菌和拟南芥中，结果显示成功转化的菌株和拟南芥植株的抗寒性及抗冻性均明显增强。因此可以推测转 AmGolS基因植株抗寒性与抗冻性增强的原因是 AmGolS催化合成了蜜三糖家族寡聚糖 (RFOs)和肌醇半乳糖苷，在植株中起到了渗透保护的作用 [10]。Cao P用同样的方法鉴定了沙冬青的 AmEBP1基因是通过加速核糖体合成来增强植物体耐寒性的 [11]。

      采用 RACE策略，张晗克隆并鉴定了一个沙冬青 CBF全长基因 ( AmCBF)，经分析该基因属于 AP2/EREBP类转录因子家族中的 CBF家族，半定量 RT-PCR实验证明该基因受低温诱导， 4℃处理 1h后有可检测剑的转录产物，2h后达到最高， 4h以后逐渐下降，24h后表达产物达最低 [12]。

    • 2.3 抗冻蛋白基因

      虽然发现了较多低温诱导基因，但还不能有效解析沙冬青强抗冻性的分子机理。然而，随着抗冻蛋白 ( Antifreeze Proteins, AFPs；也叫热滞蛋白或温度迟滞蛋白 , THPs)的发现，对沙冬青的强抗冻性能又有进一步的解析。

      抗冻蛋白是对那些直接与冰晶核相互作用，抑制冰晶核的形成和生长，从而降低溶液冰点的，这类抗冻蛋白物质的统称。AFPs有三大效应，一是热滞效应，即能降低溶液冰点；二是冰晶形态效应，在有冰晶的情况下抑制冰晶生长并使冰晶形态改变；三是重结晶抑制效应，即在冰晶生成时抑制重结晶的发生，令形成的晶粒小而均匀。低温导致结晶生成时令 AFPs活化， AFPs通过吸附作用降低溶液的冰点抑制冰晶的生长速度，保护细胞膜免受冷冻损伤，但一旦温度回升，或是酸碱度降低时， AFPs又会失去活性。而这种由 AFPs引起的溶液熔点与冰点之间的差值，就称为热滞活性 ( Thermal Hysteresis Activity, THA)。

      抗冻蛋白 20世纪 60年代首先在在极区海鱼血清中发现；随后在昆虫中也相继发现； 1992年加拿大 Griffith等首次在植物中提取到内生 AFPs。之后，美国圣母大学 Duman实验室又在多种植物中发现了该类蛋白， 1996年费云标等首次在沙冬青叶片分离到了抗冻蛋白 (沙冬青 AFPs的详细分离纯化方法，可参考 Wang W[13] 2003)。

      2000年费云标等对从冬季沙冬青叶片分离纯化的分子约为 50 kD的 AFPs进行了理化特性分析,经 Shiff试剂检验,鉴定该蛋白为含糖的 AFGP；用 DSC(差示扫描量热法 )测得其 THA在 5 mg/mL时约为 0.35；CD分析 (圆二色性分析)显示 ,该 AFGP中α -螺旋为 11%,反平行 β ­折叠为 34%,无规则线团为 55%[14]。经进一步分析沙冬青中提取的其他 AFPs发现，沙冬青 AFPs与动物 AFPs具有结构上差异。 2009年詹彬在研究新疆沙冬青 AFPs的二级结构时发现无规则卷曲 (占 72.9%)和β -折叠结构 (占 19.21%)明显高于 α ­螺旋 ( 7.88%)，说明这些无规则卷曲与 β -折叠结构很可能与该蛋白的抗冻性能有关 [15]。说明植物 AFPs与一些鱼类 AFPs具有一定的相似性，也存在一定的区别，抗冻过程中植物 AFPs与更多其他抗寒冻因子协同作用。

      2001年周晓蕾、陈滔滔等人对从沙冬青叶片提取的 6种成分进行了分析，其中 P3S1蛋白经 DSC测得具有明显的热滞活性， P3S1蛋白溶液的熔融过程明显由高低两个吸热峰叠加组成，其冻结峰也表现出双峰叠加的特征，这种现象说明 P3S1与水和冰晶的相互作用是两种不同的方式，那么很有可能它就是 AFPs的一个重要成分。而另外五种成分 ( P2S2, P2S3, P2S4, P3S4, P4S5)因过冷点低，超出了仪器的测量范围，无法得到有效的数据 [16]。

      2004年王维香从沙冬青冬季叶中分离纯化到两个抗冻蛋白： amAFP28和 amAFP37。amAFP37分子量为 37.1 kDa，THA在 5 mg/mL蛋白浓度时为 0.24℃。amAFP28。amAFP28的 pI为 6.68，分子量为 28 kDa，不含碳水化合物，紫外吸收值在 250 nm~278 nm之间，THA在 10 mg/mL蛋白浓度时为 0.15℃，二硫键不是 amAFP28抗冻活性所必需的。另外 amAFP28富含 Asp、Thr、Glu这些亲水性氨基酸残基及 Ser、Ala、Val这类小分子量氨基酸残基 [17]。

      杨杞和白肖飞等利用了 RT-PCR和 RACE技术克隆了沙冬青 CBF／ DREBl基因 cDNA序列，并对其 DNA和氨基酸序列进行了分析，结果表明沙冬青 CBF／ DREBl基因属于 CBF家族，为 AFPs基因的转录调节因子 [18]。Shang G等则通过突变令沙冬青中的 CBL1过量表达，结果发现突变植株中晶体衍射并不好，这说明 CBL1基因的表达影响了 AFPs的表达 [19]。沙冬青 CBF／ DREBl转录因子的克隆及 CBL1基因表达的研究为进一步研究植物抗逆和获得抗性基因提供了新的候选基因。

    • 2.4 遗传多样性

      魏岩、石庆华对两种沙冬青的酯酶同工酶酶谱进行比较发现，两种沙冬青作为独立的种有其遗传学基础，但属内种间亲缘关系很近，遗传相似度为 0.67，这一结果与 Ge XL等的研究结论一致[20]。詹彬在研究小沙冬青抗冻蛋白基因时利用 RT­PCR及 RACE技术从小沙冬青幼苗的 AFPs基因获得 ORF(Accession Number: GQ200581)，序列全长 609 bp，编码 203个氨基酸。同源性分析表明，该 ORF与同属蒙古沙冬青 AFPs基因序列同源性为 65.7%，氨基酸序列同源性为 76.68%。另外她还将以新疆沙冬青幼苗基因组设计出扩增 AFPs基因的 ORF引物序列，与利用其 cDNA为模板获得的 ORF序列进行比较，发现两序列完全一致，说明新疆沙冬青 AFPs基因是连续的无内含子，也说明该基因在植物进化过程中高度保守 [15]。尹林克、张娟也认为沙冬青属内种遗传相一致，原因是两种沙冬青种子中 9种主要结合氨基酸含量之和占总氨基酸的含量均在 73.71%~76.07%之间 [21]。

      为进一步研究沙冬青的遗传多样性，詹彬等再次提取新疆沙冬青总 RNA，克隆出新疆沙冬青 AFPs基因的保守区域。序列分析表明，对比于蒙古沙冬青冷诱导因子序列，两者同源性达 98.15%，同时又有一定的种间异质性 ( 1.85%)，反应了属间的差异及生物多样性，符合分类学和遗传学规律。

    • 2.5 分子遗传学

      2003年余艳、陈海山等以沙冬青基因组 DNA为 ISSR-PCR模板，不断优化反应体系，最终得到沙冬青 ISSR-PCR最优 20 μL反应体系： DNA模板 20 ng/μL，10 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)， 50 mmol/L KCl，0.1% Triton×100，2.75 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTP，2% formamide，200 nmol/L primer，1.5 u Taq酶。并从 100个 ISSR引物中筛选出 15个适合沙冬青 ISSR分析的引物 [22]。

      郭九峰、孙国琴等用 pBluescript II SK(+)载体构建了沙冬青越冬叶片 cDNA文库，该文库共有 542条表达序列标签，经 BlastN和 BlastX分析，有 313条为已知功能基因的标签，其中有 48条被确定与沙冬青的抗逆性相关，这些研究可用于进一步研究沙冬青的抗逆分子机理 [23]。

      王丹丹、尹伟等以 3种逆境处理的沙冬青为材料，用 Trizol法和改良 CTAB法提取到高质量总 RNA，采用 EcoRI/Msel酶切体系，从 64对选择性扩增引物中选出 35对适合用于沙冬青 cDNA­AFLP分析的引物，建立了适合于沙冬青 cDNA­AFLP的反应体系，为利用 cDNA-AFLP标记对沙冬青抗逆基因进行深入研究奠定了基础 [24]。乔慧蕾、王瑞刚等成功克隆了沙冬青中的脱水素基因并构建成植物表达载体，再通过农杆菌介导成功导入烟草中，为研究沙冬青脱水素基因的功能及表达奠定了基础 [25]。李晓东、白晨等为进一步研究沙冬青脱水素的功能，对克隆到的脱水素基因内部的一个碱基进行定点突变，成功连接到 pCAMBIA3301载体后，用冻融法将该表达载体质粒导入根癌农杆菌菌株 LBA4404中，再通过农杆菌介导遗传转化到糖用甜菜中，获得了 Km抗性的甜菜植株并能移栽到花盆中 [26]。

  • 3 沙冬青提取物研究

      沙冬青是传统蒙药之一，如沙冬青的茎、叶的煎煮液对冻伤具有明显疗效。沙冬青的化学成分复杂，研究工作已经有 40多年，其中关于生物碱类研究的工作报道较多，其次是关于黄酮类化合物的研究，而其他成分报道较少。近年来，对沙冬青的化学成分的功能研究正日益受到重视，这一资源的开掘可更好的造福人类。

    • 3.1 枝叶提取物

      2004年邵志宇首次在蒙古沙冬青地上部分提取到 5种非生物碱：β -谷甾醇、白藜芦醇 5,7,4’-三羟基异黄酮、 maackiain和 7,3’-二羟基 -4’-甲氧基异黄酮。 2008年 Tian XM等人应用硅胶和 Sephadex LH-20凝胶柱色谱法以及高效液相色谱法，从蒙古沙冬青地上部分分离出 10种化合物，经 NMR和 MS等方法鉴这有 9种化合物是首次在沙冬青属植物中发现，分别是：间羟基苯甲酸、对羟基苯乙酮、 (－)-丁香脂素、 (+)-落叶松脂醇、blumenol A、blumenol B、β -胡萝卜苷、松柏苷和丁香苷 [27]。2010年张兴群、杨晓霞等再次在蒙古沙冬青地上部分得到另 2种非生物碱类化合物，通过波谱学方法及与文献对照的方法鉴定为：芒柄花素和 trifolirhizin。

      2008年雷雪静、贺达汉等研究了沙冬青茎杆甲醇提取物对小菜蛾幼虫生长发育的抑制作用，了现该提取物对小菜蛾幼虫历期影响不明显，但是使蛹期延长、幼虫死亡率升高，且随着提取物浓度的提高这种作用越明显 [28]。2009年在高雯芳、朱阁等发表的论文中，他们以采自内蒙古的沙冬青为材科，研究其不同浓度提取物对松材线虫的生物活性，结果显示，沙冬青提取浓度在 1 g/L及以上都有杀虫效果，杀虫活性好于骆驼篷 [29]。这些研究说明沙冬青提取物在农药方面具有广阔的开发前景。

    • 3.2 果实提取物

      JA1是沙冬青种子的提取物成分之一。 2005年贾宁等首次报道了 JA1对体外培养的人肝癌 HCC细胞具有诱导凋亡作用，在 2006年其与 An LZ的报道中证实了这一作用，推断 JA1可用以治疗肝癌 [30]。并在 2008年与方梅进一步探索了梯度浓度 JA1对体外 HCC-9724的细胞周期、细胞线粒体膜电位及 wt-p53蛋白表达的影响，发现经 JA1处理后 HCC-9724细胞周期各时相分布发生改变，细胞在 G1被阻滞，细胞线粒体膜电位明显下降，且剂量越大下降时间越短，而 wt-p53蛋白阳性细胞百分率则随时间延长而增加，说明 JA1诱导了 HCC-9724细胞线粒体膜电位的下降和细胞凋亡，而 wt-p53蛋白表达的增强则是 JA1诱导 HCC-9724细胞凋亡的重要分子机制之一 [31]。同年，贾宁等再次研究了 JA1对体外培养的 Hep肿瘤细胞的抑制作用，发现 JA1对 Hep也有有明显的抑制作用且随 JA1浓度的增加抑制作用加强，体内试验进一步证明， JA1对小鼠皮下移植性 Hep肿瘤生长也有明显抑制作用，抑制作用随着 JA1剂量的增大而增强 [32]。贾宁的一系列研究说明 JA1具有良好的抗肝癌效果，适于进一步开发用于癌症的治疗。

      肖雯等采用薄层层析和硅胶柱层析法沙冬青种子中分离得到 7种生物碱，经核磁共振和质谱分析，确定其中 5种分别为 17-氧基金雀花碱、 β-异金雀花碱、 3α-羟基金雀花碱、金雀花碱和 3β-羟基金雀花碱。其中金雀花碱是最主要的成分 [27]，金雀花碱能兴奋呼吸，使心跳加快、血压急剧上升，对大脑循环有增压作用，在临床上可用于抢救窒息性毒剂、氰类毒剂、麻醉药等引起的窒息，但大剂量则可以倒致死亡 [33]。

  • 4 沙冬青作为抗逆模式灌木的研究展望

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