研究区域位于大兴安岭呼中国家自然保护区内，样地位于2014 年建成大兴安岭兴安落叶松林25 hm² 国际性监测样地内（见图1）。样地海拔为847 ～ 974 m，年均气温-4 ℃，年均降水量458.3 mm，年相对湿度平均为71%，年蒸发量平均为911 mm。群落结构比较简单，以兴安落叶松为主要优势种的寒温带针叶林，藓类兴安落叶松林、杜香兴安落叶松林、草类兴安落叶松林和杜鹃兴安落叶松林4 种主要群落类型（下文中分别以A、B、C、D 代替）从坡底部到坡顶部呈自然分布。样地内共有胸径（D_bh）＞ 1 cm 的木本植物41 种，其中乔木4 种，灌木37 种，草本127 种，隶属于21 科39 属。

藓类兴安落叶松林位于样地坡底部，地势平坦，土壤为沼泽土，乔木均为兴安落叶松，主要灌木包括柴桦Betula fruticosa、细叶沼柳Salix rosmarinifolia 等，主要草本包括灰脉苔草Carex appendiculata、黄囊苔草Carex korshinskyi 等。杜香兴安落叶松林位于样地阳坡下部，坡度较小，土壤为表浅棕色针叶林土，乔木为兴安落叶松和白桦Betula platyphylla，主要灌木包括细叶杜香Ledum palustre、笃斯越桔Vaccinium uliginosum 等，主要草本包括二叶舞鹤草Maianthemum bifolium、地榆Sanguisorba officinalis 等。草类兴安落叶松林位于样地阳坡中上部，坡度较大，地势陡峭，土壤为生草棕色针叶林土，乔木为兴安落叶松和白桦Betula platyphylla，灌木较少，主要为兴安杜鹃Rhododendron dauricum 和绣线菊Spiraea salicifolia，草本植物较多，主要为北野豌豆Vicia ramuliflora、小白花地榆Sanguisorba tenuifolia var.alba、二叶舞鹤草Maianthemum bifolium、龙江风毛菊Saussurea amurensis、毛蕊老鹳草Geranium platyanthum、小叶章Calamagrostis angustifolia 等。杜鹃兴安落叶松林位于样地山顶部，地势较为平坦，土壤为典型棕色针叶林土，乔木为兴安落叶松和白桦Betula platyphylla，主要灌木为兴安杜鹃Rhododendron dauricum 和越橘Vacciniumspp，主要草本为红花鹿蹄草Pyrola incarnata和龙江风毛菊。

图1 试验区位置- 呼中国家自然保护区
Fig 1 Location of sampling sites in Huzhong national nature reserve

2016年7月在四个林型中分别选定20 m×20 m的标准样地，做森林群落结构调查。以S 型选取3 个取样点，将凋落物和腐殖质层移除，用直径为10 cm 的土钻采集土层0 ～ 10 cm 土壤，挑出凋落物、细根、和小石块等杂物后过2 mm 尼龙筛并分成2 份，一份用于土壤微生物磷酸脂肪酸测定；另一份用于测定土壤理化测定。

土壤含水率采用烘干法测定，pH 值采用电位法，土壤总氮、碱解氮、有机碳采用CN 元素分析仪测定，土壤全磷采用钼锑抗比色法，土壤有效磷采用 NaHCO₃ 浸提比色法，土壤全钾、速效钾采用火焰光度计法。

土壤微生物总DNA 提取采用美国强力土壤试剂盒（MOBIO12888），按照说明书的操作步骤进行提取。将提取出的土壤微生物总DNA 溶解在100 μL 去离子水中，取5 μL 的DNA 用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测（0.5×TAE 缓冲液），分析DNA 的完整性和相对浓度并由测序公司进行高通量测序。真菌ITS 扩增引物采用通用引物（3NDF/V4_euk_R2）。根据 barcode 标签序列和前引物序列筛选出有效序列后，将测序接头与barcode 序列去除，并对处理后的有效序列进行数据统计。用mothur 和chopseq 对所得序列进行分析，以97% 相似性为标准划分操作分类单元。将优化序列根据silva 库中的参考序列对 OTU 进行种属鉴定。在门（phylum）和属（genus）的水平上做样品群落分布柱状图，比较4 个土壤环境中的真菌分布情况^[11]。

用Coverage 表示测序深度指数， 分别用Ace 和Chao1 指数表示群落丰度，用Simpson 和Shannon 指数表示真菌群落物种的丰富度和多样性；以上指数用mothur 进行分析。土壤理化性质使用SPSS17.0 软件分析，显著性分析采用单因子方差分析（ANOVA）和最小显著差数法（LSD），不同林型土壤特征对土壤微生物量的影响采用R语言中的线性冗余分析（RDA）。

由表1 可以看出，4 个林型的土壤含水率随海拔升高而降低并存在显著性差异，其中藓类兴安落叶松林含水率最大，接近90%，趋向饱和状态，该林型与其它3 个林型含水率存在较大差异。从pH 值可以看出各林型土壤均为酸性，其中杜香兴安落叶松林土壤pH 值酸性最强并与其他3 个林型存在显著性差异。4 个林型土壤各营养元素之间存在不同程度的显著性差异。藓类兴安落叶松林土壤全氮、碱解氮含量最高并明显高于其它各林型，土壤全氮随海拔升高而降低。全磷各林型差距不大，随海拔升高而降低并存在显著性差异。有效磷藓类兴安落叶松林明显高于其它各林型并存在显著性差异。土壤全钾和速效钾含量杜香兴安落叶松林较低，4 个林型无明显分布规律。土壤有机碳藓类兴安落叶松林最高，杜香兴安落叶松林最低，4 个林型无明显分布规律。

表1 不同林型土壤理化性质†
Table 1 Soil physical and chemical characteristics in different forest types

土壤样品原始序列条数为73 558，通过优化过滤低质量序列后得到有效序列总数为68 446。供试土壤样品序列经拆分、去冗余后在97% 相似度下进行OTU 聚类，共得到636 个OTU。如图2所示，不同类型土壤的样品稀释性曲线均趋向平缓，但尚未呈现饱和；这说明了供试样品取样合理，测试数据量合理，实际土壤环境真菌群落结构置信度较高，能够真实的反映土壤样本的真菌群落，但可能还有一些少量的微生物没有被发现。

如图3 所示，不同类型土壤环境中真菌的Venn 图可以看出， OTU 总数B ＞ C ＞ D ＞ A，分别为218、198、118、102，各样地OUT 总数差别较大。土壤真菌特有OTU 数目B ＞ C ＞ A ＞D，分别为115、112、50、30。4 个林型土壤真菌共有OTU 数目为9 个，ABC 为16，ABD 为12，BCD 为30，AB 为23，AC 为42，AD 为21，BC为55，BD 为74，CD 为41。共有OUT 数目表示各样地彼此之间存在不同的相似性，结果可以看出 B、C、D 林型具有相同的OUT 数目更多，说明其相似性更大。

图2 相似度为0.97 条件下各土壤样品的稀释性曲线
Fig 2 Rarefaction curves of each soil sample at cutoff level of 3%

Coverage指数是表示各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。如表2 所示，不同类型土壤环境样品测序的coverage 指数B 林型最高为0.999，A 林型和C 林型为0.998，D 林型最低为0.997。说明本试验的测序结果能够准确的反映供试土壤样品的真实情况，这与稀释性曲线显示的结果相一致。

Ace 指数和chao1 指数是用来估计群落中OTU 数目的指数，是生态学中估计生物物种总数和菌群丰富度的常用指数。如表2 所示，不同林型土壤真菌的Ace 指数和chao1 指数B ＞ C ＞D ＞ A，说明B 林型中的土壤真菌总数和菌群丰度最高，而A 林型的Ace 指数和chao1 指数最低。

图3 韦恩
Fig 3 Venn diagram

表2 相似度为0.97条件下各土壤样品多样性指数分析
Table 2 Diversity index of each soil sample at cutoff level of 3%

用Shannon 指数和Simpson 指数来估算供试土壤样品中微生物的alpha 多样性。Shannon 指数B ＞ C ＞ A ＞ D，说明B 林型土壤真菌群落的信息量最大且复杂程度最高。Simpson 指数B ＞ C ＞A ＞ D，说明D 林型土壤真菌群落的均匀度最高。

测序共获得4 门11 纲36 目63 科74 属真菌。图4 所示，在门分类水平上分属于4 个主要类群，主要包括子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、接合菌门Zygomycota、壶菌门Chytridiomycota。担子菌门在所有样品中的丰度为9.41% ～ 86.72%，在藓类、杜香、杜鹃兴安落叶松林中为最优势菌门，表现出明显的优势地位。子囊菌门在所有样品中的丰度为7.74% ～ 64.27%，在杜香兴安落叶松林中为最优势菌门，在其它3个林型中为次优势菌门。此外壶菌门只存在于草类兴安落叶松林土壤中，相对丰度为0.43%。

在属分类水平上，藓类兴安落叶松林包含31属土壤真菌，其中隐球菌属Cryptococcus 相对丰度最高，为22.39%，为优势菌属；其余相对丰度较高的依次为Udeniomyces（3.71%）、小轮孢霉属Troposporella（2.07%）、Rachicladosporium（1.53%）。杜香兴安落叶松林包含46 属土壤真菌， 丝膜菌属Cortinarius 相对丰度最高， 为17.74%，为优势菌属；其余相对丰度较高的依次为拟锁瑚菌属Clavulinopsis（5.63%）、被孢霉属Mortierella（5.63%）、Udeniomyces（2.56%）、隐球菌属Cryptococcus（2.19%）、木霉属Trichoderma（1.43%）、Kriegeria （1.28%）、丝座盘菌属Arachnopeziza（1.05%）、Neonectria（1.02%）。草类兴安落叶松林包含47 属土壤真菌，隐球菌属Cryptococcus 相对丰度最高，为4.60%，其次为虫草属Cordyceps，相对丰度为2.28%。杜鹃兴安落叶松林包含25 属土壤真菌，拟锁瑚菌属Clavulinopsis 相对丰度最高，为7.06%。结果说明不同林型土壤真菌在属分类水平上分布不同，优势菌属不相同，共有菌属相对丰度也不同。

图4 门和属分类水平下的微生物群落组成
Fig 4 Composition of microbial communities at phylum level and genus level

在属的水平上对不同类型土壤环境中的真菌样品和样品所含菌属进行聚类，对聚类后的各样品中不同OTU 所含序列丰度作出heatmap（图5），该图能够反映不同类型土壤真菌在属水平上的群落结构差异性。由图5 可以看出，不同土壤类型的真菌heatmap 图可以划分为3 个Cluster。不同林型的土壤真菌的相对丰度和分布发生了明显的变化，在供试样品所得菌属中相对丰度变化较大的有Cortinarius、Clavulinopsis、Mortierella、Cryptococcus、Trichoderma。

从图5 可以看出，Cluste 1 中相对丰度较高的13 属真菌存在于C 样地中， 并与其它3 个样地存在较大差异； 其中Mrakia、Neonectria、Meliniomyces、Archaeorhizomyces 等属真菌的相对丰度受土壤环境变化影响较大。Cluste 2 中相对丰度较高的16 属真菌存在于B 样地中， 并与其它3 个样地存在差异； 其中Trichoderma、Cordyceps 等属真菌的相对丰度受土壤环境变化影响较大。Cluste 3 中相对丰度较高的4 属真菌存在于A 样地中，并与其它3 个样地存在差异；其中Cryptococcus、Mortierella 等属真菌的相对丰度受土壤环境变化影响较大。3 个Cluste 分别对应了A、B、C 3 种类型土壤环境中的土壤真菌的组成和相对丰度，而D 样地又与此不同，这说明不同类型的土壤环境下土壤真菌组成和相对丰度存在较大差异。

图5 基于ITS 序列构建的热图
Fig 5 Heatmap tree based on the ITS sequences

土壤真菌因不同林型的环境因子而聚类或分离的情况如图6 所示，土壤pH 值、土壤全氮、碱解氮、有机碳、含水率与第一排序轴正相关，土壤全钾、有效钾、全磷与第一排序轴负相关。不同林型土壤真菌组成差异较大，A 林型位于第一象限，B 林型和D 林型位于第三象限，C 林型位于第二象限，这说明B 林型和D 林型土壤真菌差异较小。Mortierella 群落与土壤全氮、有机碳、含水率、碱解氮、pH、全磷正相关，与全钾、速效钾负相关。Udeniomyces、Cortinarius、Cryptococcus、Trichoderma 与土壤磷含量和含水量负相关。Cordyceps、Clavulinopsis 与有效磷正相关，与pH 值、含水率负相关。

图6 基于土壤真菌种群分布和环境因子的冗余分析
Fig 6 RDA based on soil fungi community at genus level and environmental factors of the soil