1. 中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室,湖南长沙 410004; 2. 中南林业科技大学生物技术实验室,湖南长沙 410004; 3. 国家林业局生物乙醇研究中心,湖南长沙 410004
1. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 3.Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration, Changsha 410004, Hunan, China
shoot cuttings; rooting; plant growth regulator; endogenous hormones
DOI: 10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.10.002
备注
以北美香柏 Thuja occidentals L. 2年生枝条为材料,采用 3-吲哚丁酸钾盐(K-IBA)3个浓度(3 000、 6 000、10 000 mg/L)处理扦插生根试验,清水处理为对照。扦插 60天后统计插穗生根率、平均根长、最长根长、平均生根数。扦插后每隔 15 d从 6 000 mg/L K-IBA与对照处理插穗的基部取样,测定生根过程中内源激素吲哚乙酸( IAA)、赤霉素 (GA)、脱落酸( ABA)和玉米素( ZT)含量的变化。结果 表明:外源 K-IBA对北美香柏扦插生根有促进作用,其中 6 000 mg/L K-IBA的处理效果最好,其生根率为 87.78%、生根数 22.33根、平均根长 12.33 mm、最长根长 75.20 mm,显著高于对照。与对照相比, 6 000 mg/L K-IBA处理组的内源 IAA含量、 GA 含量提高,而内源 ABA、ZT含量下降,促使生根率提高。在北美香柏扦插生根过程中, K-IBA处理调节了内源激素 IAA、GA、ABA和 ZT含量的变化,而内源激素的动态变化,共同调控插穗不定根的形成。
The shoot cuttings of Thuja occidentals L. were collected and treated with indole-3-butyric acid (K-IBA) (concentrations 3 000, 6 000 and 10 000 mg/L), Water treatment as a control. The rooting rate, average root length, the longest root length and average rooting number were recorded after cutting for 60 days; The endogenous hormones(IAA, GA,ABA, ZT) contents of cuttings of 6 000 mg/L K-IBA and control treatment were detected every 15 days interval.The significant difference was found among the four treatments. K-IBA promoted the rooting of Thuja occidentals L, Among them, 6 000 mg/L K-IBA has the best treatment effect, which was significantly higher than that of CK. The rooting rate was 87.78%, the number of rooting was 22.33, the average root length was 12.33 mm, the longest root length was 75.20 mm. Compared with the control, the content of endogenous IAA and GA increased in 6 000 mg/L K-IBA treatment group, while the contents of endogenous ABA and ZT decreased, then promoted the rooting. K-IBA regulates the changes of endogenous hormones IAA, GA, ABA and ZT, and the dynamic changes of endogenous hormones regulate the formation of adventitious roots in the process of rooting.
引言
北美香柏Thuja occidentals L.,别名美国侧柏,为柏科崖柏属,常绿乔木。原产于北美东部,我国辽宁、山东、湖南、北京等地有引进栽培[1]。北美香柏喜光,耐荫,能适应多种土壤,以肥沃的中性土及石灰岩发育的碱性土上生长为佳,抗寒力强,是石灰岩区困难地造林的首选树种之一,能尽快恢复石灰岩地区的植被,防止水土流失。木材的用处较多,可作为各类建筑材料。枝叶芳香,富含维生素、黄酮、萜类等多种活性成分,是抗坏血病、抗衰老、预防心脑血管疾病的良药。从枝叶中提取的精油芳香迷人、抑菌驱虫,是高级香水、香油、建筑清洁剂的优质原料 [2]。树形优美,可作观赏树种。其生态效益、社会效益十分显著。北美香柏主要通过扦插途径繁殖,然而扦插生根机理尚不清楚。本试验研究了外源激素 K-IBA处理对北美香柏扦插生根的影响及北美香柏生根过程中内源激素的变化,旨在探讨其扦插生根机理,为该树种的引种推广栽培提供无性繁殖理论依据。
1 材料与方法
2 结果与分析
3 讨论
由北美香柏扦插生根的形态观察,扦插 30 d愈伤组织全部形成,说明在扦插第 30 d之前已有少量根原基的形成与分化。扦插后 30~ 45天为插穗基部分化生根的高峰期,根原基的诱导形成,扦插 45天之后生根数量变化较小,根不断伸长。
清水处理,生根率 54.44%,表明北美香柏为较易扦插生根的树种。 K-IBA对香柏生根有促进作用,但高浓度的 K-IBA会有一定的抑制作用。外源添加高的植物生长调节剂抑制了根内源生长素的含量,影响到细胞的分裂与分化 [3]。不同物种 K-IBA的使用,结果存在着一定的差异。 Griffin 等 [4]用 K-IBA对大叶紫茉莉处理,发现其对生根有明显的促进作用,随着浓度升高生根数量增加,但高浓度的 K-IBA会有一定的抑制作用;张斌 [5]利用 K-IBA处理仿栗插穗, K-IBA能改善插穗的营养状况,提高抗逆境能力,进而提高生根效果, 3 000 mg/L的处理效果最好。在本实验中,可以看出 K-IBA处理浓度与生根率、平均根长、最长根长和平均生根数都具有显著性, K-IBA处理插穗后随着浓度升高愈伤组织形成率、生根率、平均根长和平均生根数都明显提高。 K-IBA能增强插穗内细胞的代谢过程,加快蛋白质和淀粉的分解,促进根原基的诱导和形成,进而促进生根 [6-9]。其中 6 000 mg/L K-IBA的处理效果最为显著。
不定根的形成受许多因素影响,包括激素、水、温度和光照等 [10]。此外还受扦插的处理方式,如留叶数、长度、切口等影响 [11]。大量研究表明激素对植物生根非常重要 [12]。在北美香柏扦插生根过程中,插穗基部 IAA含量是随着生根阶段不同而发生变化的。图2-A显示 6 000 mg/L K-IBA处理的插穗在扦插第 30天达到最高值,而后逐渐下降。据形态观察发现,第 15~ 30天是北美香柏插穗根部膨大、诱导形成愈伤组织阶段。后 IAA含量下降,反而对北美香柏扦插不定根的伸长有促进作用。 IAA含量的变化和根原基出现的阶段与 Blakesley[13],詹亚光 [14],刘明国 [15],欧阳芳群 [16]等研究结果趋同。 6 000 mg/L K-IBA处理组始终高于对照组原因可能是 6 000 mg/L K-IBA处理影响了 IAA的合成。 GA通过改变根内皮层细胞分裂和伸长的速度,来影响根中其他细胞的分裂和伸长,继而调控根的生长 [17-19]。如图2-B,对照组 GA含量在愈伤组织形成期稍微下降,在根原基形成与不定根伸长阶段升高。 6 000 mg/L K-IBA处理组 GA含量始终高于对照组,且在根原基形成与不定根伸长阶段表现尤为明显,能够促进根的伸长。在北美香柏扦插生根过程中, 6 000 mg/L K-IBA处理组的内源 ABA含量普遍低于对照组(图2-C),可能是因为 K-IBA处理影响插穗内 ABA 的合成,导致内源 ABA含量下降,而 ABA是生长抑制激素,其含量的下降提高了生根率。玉米素属细胞分裂素,利于植物的生长、分化。由图2-D,在北美香柏扦插过程中 6 000 mg/L K-IBA处理组 ZT值总体趋势与对照组一致,在愈伤组织出现与根原基形成初期的 0~ 15天内, ZT含量下降;在不定根基本形成 15~ 45天时, ZT 含量略有回升;在不定根形成后 45~ 60天时又稍下降。6 000 mg/L K-IBA处理组北美香柏插穗 ZT值总体低于对照组,说明 6 000 mg/L K-IBA处理北美香柏插穗也引起插穗内部玉米素 ZT 的下降反而有利于生根。
内源激素的作用不是单一的,而是互相作用,协同参与愈伤组织的形成、根原基的诱导和形成、不定根的形成与伸长。不同内源激素含量比值的大小对不定根形成能力的反应比单一内源激素的更具有说服力。 IAA/ABA和 IAA/ZT比值常用作评判植物扦插生根难易的标准 [20]。IAA/ABA比值变化与生根有关系。陈雪梅等 [21],敖红等 [22],周再知等 [23]表明 IAA/ABA比值大,生根率高,反之,生根率低。由图3-A可知,6 000 mg/L K-IBA处理组的内源 IAA/ABA比值普遍高于对照组,说明外源 K-IBA处理北美香柏插穗促进生根; IAA/ABA比值在扦插后 30 d内升幅大,利于根原基形成。 IAA/ZT比值表现出与 IAA/ABA比值相似的变化趋势,且 IAA/ZT比值都是大于 1,说明插穗内源激素 IAA含量高于 ZT含量,有利于不定根的形成。
4 结论
外源 K-IBA对北美香柏扦插生根有促进作用,其中 6 000 mg/L K-IBA的处理效果最好,其生根率为 87.78%、生根数 22.33根、平均根长 12.33 mm、最长根长 75.20 mm,显著高于对照。与对照相比, 6 000 mg/L K-IBA处理组的内源 IAA含量、GA 含量提高,而内源 ABA、ZT含量下降,促使生根率提高。在北美香柏扦插生根过程中, K-IBA处理调节了内源激素 IAA、GA、ABA和 ZT含量的变化,而内源激素的动态变化,共同调控插穗不定根的形成。
2.1 K-IBA处理对北美香柏扦插生根效果的影响从表1 中可看出,在不同 K-IBA浓度处理下,插穗的生根率、平均根长、最长根长和平均生根数指标差异显著(p< 0.05)。随 K-IBA浓度的增加,插穗的生根率和最长根长都是先升高,当 K-IBA浓度为 6 000 mg/L时,生根率达最大值 87.78%,而后随浓度的升高而降低,当 K-IBA处理浓度为 10 000 mg/L时其生根率与 3 000 mg/L K-IBA浓度处理组差异不显著, 3个 K-IBA浓度处理的生根率分别比清水处理对照组提高 23.34%、33.34%和 21.11%。3个 K-IBA浓度处理下的插穗的平均根长、最长根长和平均生根数也均显著高于对照处理组,随着浓度的不断升高平均根长是先升高后降低再升高的,最长根长在 6 000 mg/L K-IBA时达到最大值 75.20 mm,平均生根数是在 3 000 mg/L K-IBA浓度时最多,平均达 25.67根。
表1 K-IBA浓度处理的扦插生根指标†
Table 1 The rooting characters of cuttings by different K-IBA treatments综合比较可以看出,在 6 000 mg/L K-IBA浓度处理下北美香柏扦插生根效果最好,其生根率为 87.78%、生根数 22.33根、平均根长 12.33 mm、最长根长 75.20 mm。
2.2 6 000 mg/L K-IBA处理插穗生根进程形态观察经生根过程插穗基部形态观察发现, K-IBA处理插穗生根情况较对照组提前。扦插后 15天, K-IBA处理插穗基部皮孔膨大外凸、呈开裂迹象,少量插穗愈伤组织开始出现(图1-A);第 30天,插穗皮部有小突起,形成少量不定根(图1-B),因此在扦插后第 30天前已有少量根原基的形成与分化;扦插后第 45天,插穗不定根开始大量形成,插穗成活率基本稳定(图1-C);扦插后第 60天,插穗不定根大量出现,且生长迅速,已经成为小苗木(图1-D)。
2.3 K-IBA处理对扦插生根内源激素含量变化的影响2.3.1 扦插生根过程中 IAA的含量变化图2-A表明,扦插后 6 000 mg/L K-IBA处理的插穗 IAA含量呈现先上升后下降的单峰变化。扦插后 15天内上升较慢,第 15~ 30天时,迅速上升,最高达到峰值 128.64 ng/(g·FW),而对照处理插穗的 IAA含量变化很小。插后 30~ 60天,6 000 mg/L K-IBA处理插穗的 IAA含量逐渐下降,对照处理插穗的则开始上升,上升量不大,第 45天时升到峰值 59.25 ng/(g·FW)。扦插 45天后,不定根逐渐伸长, 6 000 mg/L K-IBA和对照处理插穗的 IAA含量都逐渐下降。
2.3.2 扦插生根过程中 GA的含量变化由图2-B可知,扦插后 6 000 mg/L K-IBA处理插穗 GA含量为先升高后降,而对照组的 GA含量先是略有下降后缓慢上升。扦插生根过程整体 GA值 K-IBA处理组>清水对照组。扦插后 6 000 mg/L K-IBA处理插穗 GA含量值逐步上升,至第 45天为最高的 7.45 ng/(g·FW),第 45~ 60天逐渐下降至 6.22 ng/(g·FW)。扦插后对照组 GA含量值整体变幅很小,至第 30天最低值 3.97 ng/(g·FW),仅比起始含量值降低了 0.12 ng/(g·FW),之后上升又缓慢下降,至 60天为 4.56 ng/(g·FW)。
2.3.3 扦插生根过程中 ABA的含量变化扦插后 6 000 mg/L K-IBA处理插穗的 ABA含量呈现迅速降低,而对照处理插穗的 ABA含量仅轻微下降;第 15天时 6 000 mg/L K-IBA处理插穗的 ABA含量下降至 77.56 ng/(g·FW),对照组仅降为 119.87 ng/(g·FW)。6 000 mg/L K-IBA处理插穗的根原基诱导和愈伤组织形成,与较低水平的 ABA含量有关。扦插至 30~ 60天,两组处理插穗的 ABA含量均逐渐下降, 6 000 mg/L K-IBA处理插穗 ABA含量下降幅度先小后大,而对照处理插穗的 ABA含量下降幅度则由大到小。最后 6 000 mg/L K-IBA处理插穗的 ABA含量下降了 59.48 ng/(g·FW),对照组只下降了 0.256 ng/(g·FW)。
2.3.4 扦插生根过程中 ZT的含量变化如图2-D 所示,ZT值在整个扦插生根过程中, K-IBA处理组<对照组。扦插后实验组和清水对照组处理插穗 ZT含量都迅速下降, 6 000 mg/L K-IBA处理组从 14.71 ng/(g·FW)降至最低值 9.54 ng/(g·FW),而扦插后 15~ 45天一直上升至峰值 19.18 ng/(g·FW),第 45天后又急剧下降。对照处理扦插 15天内, ZT含量从 14.71 ng/(g·FW) 持续下降到 5.99 ng/(g·FW),而后又逐步上升,经过 30天上升到峰值 11.99 ng/(g·FW),而后也急剧下降。在整个扦插进程中, 6 000 mg/L K-IBA处理插穗 ZT 含量始终低于对照。
2.3.5 扦插生根过程中 IAA/ABA值的变化如图3-A 所示,6 000 mg/L K-IBA 处理插穗IAA/ABA 比值在扦插后30 天内大幅度升高,达到1.30,此时正是插穗不定根原基形成和发育的时期,扦插后30 ~ 45 天后急剧下降,继而上升。对照处理插穗的 IAA/ABA 比值扦插后30 天内变化不大;第30 ~ 45 天,IAA/ABA 比值微微升高,45 ~ 60 d 逐步下降至扦插开始时数值,对照处理插穗的 IAA/ABA 比值扦插后总体变幅不大。
2.3.6 扦插生根过程中IAA/ZT 值的变化如图3-B 所示,6 000 mg/L K-IBA 处理的IAA/ZT 比值在插穗生根过程中表现出明显的先上升、后下降、再升高的变化趋势,而对照处理组的 IAA/ZT 值的变化较平缓,呈现先缓慢上升后下降趋势。在两种不同处理扦插后第 15~ 45天各处理的 IAA/ZT值差异最大,且大部分时间内 6 000 mg/L K-IBA处理的 IAA/ZT比值大于对照处理组,扦插后 30天时 6 000 mg/L K-IBA处理比对照组的插穗 IAA/ZT值高 4.05。
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1.1 材料插穗选择:于湖南湘西州森林生态研究试验站北美香柏实验基地选取生长健壮、无病虫害的北美香柏 Thuja occidentals Green Giant品种, 2年生 8~ 12 cm枝条,插前剪去部分靠近基部老叶,扦插于中南林业科技大学苗圃。温度保持在 20~ 30℃。
生长调节剂 K-IBA (3-吲哚丁酸钾盐 )购自 Sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)有限公司。
1.2 方法1.2.1 扦插试验设计采用单因素完全随机区组设计,设置 3个 K-IBA浓度(3 000、6 000、10 000 mg/L)处理,清水对照,每个组重复 3次,每组 30个插穗。
1.2.2 扦插处理按珍珠岩:泥炭土 3 ∶ 1体积比配置混合扦插基质,装入 7 cm×6 cm×7 cm无纺布网袋中,放入穴盘上。扦插前 2 d,用 0.5%高锰酸钾对基质消毒。将制备好的插穗每 30条扎成 1 捆,然后用 0.1%的高锰酸钾溶液消毒 60~ 90 s。取出用超纯水冲洗干净。用 3个不同浓度 K-IBA溶液浸泡插穗形态学下端 2~ 3 cm处 20 s,清水浸泡为对照,扦插深度 3~ 4 cm。扦插后,及时浇水,用 50%多菌灵可湿性粉剂 500 倍液消毒,每隔 7天于傍晚给插穗喷洒 1 次。相对湿度稳定于 80%以上。
1.2.3 指标测定1.2.3.1 生根测定扦插后,每隔 15天进行 1次生根形态观测,分别记录愈伤组织出现期、不定根出现期和发生的部位以及根系的生长过程,扦插 60 d后统计插穗生根率、平均根长、最长根长、平均生根数。
1.2.3.2 高效液相色谱( HPLC)测定内源激素(IAA、GA、ABA、ZT)含量扦插后,每隔 15天,从 6 000 mg/L K-IBA和对照处理中取样 1次,共计 5 次。从每个重复中随机抽取 10~ 12 条插穗,迅速用蒸馏水将基部冲洗干净,滤纸擦干,然后置于冰盒内带回实验室,迅速剥取穗条基部 2~ 3 cm 韧皮部,剪碎混匀后用液氮速冻,放于 -70 ℃冰箱中保存待测。
称取样品 3 g用液氮研磨成粉于离心管中,加入 40 ml 80%的预冷色谱甲醇,加入少量抗氧化剂,摇匀, 4℃避光浸提 12 h。将浸泡提取的北美香柏样品于 4℃ 3 000 r/min离心 20 min,收集上清液。残渣再次用20 mL 80%的预冷甲醇浸提 12 h, 3 500 r/min 4℃离心 15 min,合并上清液。 38℃旋转蒸发,除去甲醇。浓缩液用等体积的三氯甲烷萃取两次,加入适量 PVP,离心 3 000 r/min离心 5 min,丢弃下层溶液,上层溶液合并,并且调节 pH至 2.8~ 3。乙酸乙酯萃取后干燥。残留物用 3 mL甲醇∶ 0.8%冰醋酸 =45 ∶ 55溶解,再用0.45 μm的微孔滤膜过滤,小玻璃杯收集滤液用于检测。用流速 0.06 mL/min高效液相色谱法(HPLC)测定 IAA、GA、ABA和 ZT的含量。
1.3 数据分析数据统计处理、图表制作运用 Excel 2010。 SPSS 22.0进行方差分析和多重比较。
学报简介
中南林业科技大学学报
《中南林业科技大学学报》原名《中南林学院学报》,是中南林业科技大学主办的以林为特色的自然科学学术期刊。该刊1981年创刊,2010变更为月刊,月底出版,国内外公开发行。国际刊号为ISSN 1673-923X,国内刊号为CN43-1470/S。该刊是教育部优秀科技期刊,全国优秀高校学报,湖南省一级期刊。是全国中文核心期刊,中国科学引文数据库来源期刊,中国精品科技期刊,中国科技核心期刊。该刊入编了国内所有的期刊数据库。
主要栏目:林学、生态学、生物科学与技术、植物学、园林、木材科学等。
读者对象:本刊适合于农林院校师生以及农林科研院所、农林管理部门和生产单位的科技和管理人员阅读,也适合于与以上学科和专业有关的其他高校师生和科技人员阅读。