准确吸取对照品溶液 1.0 mL，移入 10 mL刻度比色管中，加入 60%乙醇 5 mL，分别加入 5%亚硝酸钠溶液 0.5 mL，振摇后放置 6 min，加入 10%硝酸铝溶液 0.5mL摇匀后放置 6 min，加入 1 mol·L^-1 氢氧化钠溶液 2 mL，用 60 %乙醇定容至刻度，快速摇匀，室温放置 15 min。同法制得空白液，在 300～ 600 nm 扫描，发现芦丁对照品溶液在 510 nm处有最大吸收峰。

准确吸取对照品溶液 1.0 mL，移入 10 mL刻度比色管中，依次加入 pH值 3.6的醋酸 -醋酸钠缓冲液 3 mL，0.1 AlCl₃溶液 3 mL，用 60%乙醇定容至 10 mL，快速摇匀，室温放置 30 min。同法制得空白液，在 300～ 500 nm波长范围内扫描，发现芦丁对照品溶液在 400 nm处有最大吸收峰。

NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色法：准确吸取芦丁对照品溶液 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，按 1.3.3.1项下的方法进行显色处理，在 510 nm处测定吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 AlCl₃比色法：准确吸取芦丁对照品溶液 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，按 1.3.3.2项下的方法进行显色处理，在 400 nm处测定吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

吸取芦丁对照品溶液 1.0 mL，按 1.3.3.2项下的方法操作，测定吸光度，连续测定 6次，RSD为 0.46%，表明该方法的精密度良好。

取杜仲雄花样品溶液 1.0 mL，显色后后分别在 10、20、30、40、50、60 min测定吸光度， RSD为 0.94%，说明样品显色后 60 min内稳定性良好。

取杜仲雄花样品 6份，按 1.3.2项下的方法制备供试品溶液，然后测定吸光度， RSD为 0.58%，表明该方法重复性良好。

精密称取已知含量杜仲雄花样品 6份，每份 0.1 g，分别加入芦丁对照品 1.0 mL，按 1.3.2项下的方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算回收率，结果见表2。

式中： r为回收率， %；M₁为样品中总黄酮含量， mg；M₂为芦丁加入量，mg；M₃为测得量，mg。

表2 加样回收率实验结果
Table 2 Results of recovery tests of total flavonoids

由表2可知， AlCl₃比色法测定总黄酮的平均回收率为 99.27%，RSD为 1.21%，说明该方法测定杜仲雄花中总黄酮具有较高的回收率。

分别吸取杜仲雄花和杜仲叶供试品溶液 1.0 mL，分别按照 1.3.3.1和 1.3.3.2项下实验步骤测定吸光度，根据线性回归方程计算出供试品溶液中芦丁的浓度，并计算杜仲雄花和叶中总黄酮的含量。

式中： P为样品中总黄酮的含量， mg·g^-1；c为标准曲线读出的供试品溶液中芦丁的浓度， μg·mL^-1；V₁为样品待测液总体积，mL；V₂为样品提取液总体积， mL；V₃为测定用体积，mL；m为样品质量，g。

采用 NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色法和 AlCl₃比色法分别测定杜仲雄花和杜仲叶中总黄酮含量，结果见表3。由表3可知， 13份样品杜仲雄花和叶中总黄酮含量均存在较大差异。 NaNO₂­Al(NO₃)₃-NaOH显色法测定结果显示： 5号样品杜仲雄花总黄酮含量最高，达到了为 41.31 mg·g^-1；其次是 4号样品和 9号样品，分别为 37.29 mg·g^-1和 37.04 mg·g^-1；3号样品总黄酮含量最低，仅为29.28 mg·g^-1。5号样品杜仲叶总黄酮含量最高，达到了 31.15 mg·g^-1；3号样品杜仲叶总黄酮含量最低，仅为 16.59 mg·g^-1。AlCl₃比色法测定结果显示： 5号样品杜仲雄花总黄酮含量最高，达到了 30.26 mg·g^-1，3号样品杜仲雄花总黄酮含量最低，仅为 17.35 mg·g^-1；杜仲叶中总黄酮含量最高的仍为 5号样品，为 20.05 mg·g^-1，含量最低的也是 3号样品，仅为 6.70 mg·g^-1。采用 2种方法测定同一份样品杜仲雄花和杜仲叶中总黄酮含量差别较大， NaNO₂­Al(NO₃)₃-NaOH显色法测定结果明显比 AlCl₃比色法偏高，此外， 2种方法测定结果均为杜仲雄花中总黄酮含量明显高于杜仲叶片中总黄酮含量。