Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China
以蛇皮果顶梢嫩叶为材料，比较了CTAB 法、改良CTAB 法、CTAB-free 法和SDS 法对基因组DNA的提取效果，并对蛇皮果RAPD 反应体系进行优化。结果 表明，CTAB 法、改良CTAB 法和CTAB-free 法均能提取出蛇皮果基因组DNA，其中NaCl 浓度为5 mol/L 的改良CTAB 法因可更有效地去除多糖及酚类物质，并能满足PCR 扩增的要求而被认为是蛇皮果基因组DNA 提取的最适方法；在15 μL 的PCR 扩增体系中，Mg2+、dNTPs 和Taq DNA 聚合酶的最优浓度分别为1.4 mmol/L、0.12 mmol/L 和0.12 U/μL；PCR 反应程序的最适退火温度为39 ℃。
By taking the tender leaves on top-shoots of Salacca edulis as tested materials, the extraction effects of CTAB, improved CTAB, CTAB-free and SDS on the genomic DNA of salak were investigated and compared. And the reaction system of salak RAPD was optimized. The results show that CTAB, improved CTAB, CTAB-free all could extracted out genomic DNA from salak, of them,the improved CTAB with NaCl concentration of 5 mol/L could more effectively remove polysaccharides and polyphenols than the othertwo methods, and meet the requirement of PCR amplification, so it is the best method. The optimal concentrations of Mg2+, dNTPs, Taq DNA polymerase and the annealing temperature are 1.4 mmol/L、0.12 mmol/L, 0.12 U/μL and 39 ℃ respectively for the PCR progress for salak.
蛇皮果Salacca zalacca (Gaertner) Voss ex. Vilm.（=S. edulis Reinw）为棕榈科Palmae 蛇皮果属果树，具有果实外形奇异、果肉铁钙含量高、林下作业不晒和经营期长等优点，可在我国海南和云南热带地区栽培[1-2]。
有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而雌雄异株的蛇皮果通过有性繁殖生产的实生苗难以从形态上区分性别，而性别不分的实生苗造林后容易产生雌株分布不均、单产低和调整成本高等问题。因此蛇皮果实生苗性别鉴定是蛇皮果栽培亟需解决的问题之一。目前在银杏和大麻上已可利用基因组DNA 分子标记技术鉴定实生苗性别[3-4]，理论上基因组DNA 分子标记技术也可用于蛇皮果实生苗性别鉴定。基因组DNA 分子标记技术的首要工作是植株基因组DNA 提取及其PCR 扩增。然而目前如何提取蛇皮果基因组DNA 及其PCR 扩增却还不清楚。有鉴于此，本研究以蛇皮果叶片为材料，筛选出蛇皮果基因组DNA 的提取方法和RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA) 反应体系最佳条件，从而为开发RAPD 分子标记鉴定蛇皮果性别和蛇皮果分子生物学研究提供技术支撑。
采样果林位于海南省定安县黄竹镇南海农场试验场，20 世纪90 年代中期种植，种源来自印度尼西亚。采集时间为2011 年5 月，共选择20 棵长势健康的植株，采集植株中上部叶子的中上部新鲜的叶片，采下后用卫生纸除去表面灰尘及水分，每棵用塑料袋单独封装，一起用冰袋保鲜，带回实验室后在-70 ℃下保存。
采用CTAB 法进行蛇皮果叶片的总DNA 提取，具体步骤如下：预先在10 mL 离心管中加入4mL 2％ CTAB 提取液（CTAB 20 g/L，NaCl 81.816g/L，EDTA 9.306 g/L，Tris-HCl 12.114 g/L，pH8.0），65 ℃保温。称取蛇皮果叶片1.2 g，剪碎，放入研钵，加液氮研磨至粉末状。将研磨好的粉末状叶样加入预热的提取液中，封口，65 ℃保温60 min，每隔10 min 摇动1 次。将样品在离心机上用11 000 r·min-1 离心10 min，然后取上清液。往上清液中加入氯仿∶异戊醇（24 ∶ 1）混合液4 mL， 摇匀， 再11 000 r·min-1 离心10 min，取上清液；重复1 次本步骤。向上清液中加入4 ℃冷藏的2 mL 异丙醇，轻轻晃动混匀，在-20 ℃下静置1 h 以上。取冷冻液，11 000 r·min-1离心10 min，倒掉上清液，加入2 mL 无水乙醇洗两次，洗后将管倒置于卫生纸上吸干，在真空浓缩仪中干燥5 min 左右。加入1 mL 1×TE，溶解沉淀的DNA，弹动或震荡以充分溶解，放入冰箱备用。DNA 浓度通过与100 bp DNA Ladder（购自Sangon 公司）的500 bp 片段亮度对比进行[5]。
改良的CTAB 法是在2％ CTAB 提取液中加入了2％ β- 巯基乙醇和5％ PVP-40，而且在加入4℃冷藏的2 mL 异丙醇之前加入2 mL 浓度为5mol/L 的NaCl，其它步骤与CTAB 法相同。
CTAB-free 法首先将研磨好的蛇皮果叶样加入到4 mL CTAB-free 提取液（PVP 15 g/L，NaCl81.816 g/L，EDTA 9.306 g/L，Tris-HCl 12.114 g/L，pH 8.0）和2％ β- 巯基乙醇中，在冰上冰浴10 min，然后7 000 r·min-1 离心10 min，去掉上清液[6]。在沉淀中加入3％ CTAB 提取液，其它步骤与改良CTAB 法相同。
SDS 法主要是将CTAB 法中的提取液换成2％ SDS 提取液，其它步骤与CTAB 法相同[7]。
扩增体系的优化因子包括Mg2+ 浓度、dNTPs浓度和Taq DNA 聚合酶浓度（见表1）。PCR 扩增体系的优化以改良CTAB 法提取的蛇皮果基因组DNA 为材料，利用随机引物S2007、S2008、S2009、S2010、S2011、S2074、S2075、S2076、S2077、S2078、S2081、S2082、S2083、S2084、S2085 进行( 引物序列见表2，均购自Sangon 公司)。15 μL 扩增反应体系基本组成为：1.5 μL 10× 缓冲液[Tris-HCl 100 mmol/L(pH 9.0)、KCl 100 mmol/L、NP-400.5 %、(NH4)2SO4 80 mmol/L]、0.2mmol/L dNTPs、0.1 U/μL Taq DNA 聚合酶、1.8mmol/L Mg2+、1.0 μmol/L RAPD 引物、12 ng DNA模板，补加ddH2O 至15 μL。
表1 蛇皮果PCR扩增体系的优化设计
Table 1 The optimization design of salak PCR amplification system
表2 蛇皮果基因组DNA扩增优化所用RAPD 随机引物名称及其碱基序列
Table 2 The RAPD random primers and base sequences of this study
PCR 扩增程序的优化是在优化的扩增体系的基础上，以改良CTAB 法提取的蛇皮果基因组DNA 为材料， 利用S2093、S2094、S2095、S2096 和S2097 共5 个随机引物进行( 引物序列见表2)。基本扩增程序为：94 ℃预变性2 min；再40 个循环：94 ℃变性30 s，36 ℃退火30 s 和72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸10 min。扩增程序的优化主要是针对退火温度的调节，退火温度设置为34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃。PCR 扩增仪为GeneAmp PCR System 2700(Applied Biosystem Co.) 。扩增产物用含有0.05μL/mL Gold ViewTM（购自北京赛百盛基因技术有限公司）的1.2 % 琼脂糖凝胶在0.5×TBE 缓冲液中电泳分离检测，电泳结果通过WD-9403F 紫外仪成像。
在完成1.3.1 和1.3.2 内容后总结出优化的扩增体系参数，利用蛇皮果1 个DNA 样品，采用该扩增体系和编号为S23-32 的随机引物( 引物序列见表2) 进行扩增，观察扩增后的电泳谱带，检验优化体系的适用性。
4种方法提取的DNA 的电泳如图1 所示。由图可以看出， 改良CTAB 法、CTAB-free 法和CTAB 法均能提取出蛇皮果的基因组DNA，而SDS 法提取的效果较差。然而3 种可提出基因组DNA 的方法中，CTAB-free 法跑出的条带比较分散，CTAB 法跑出的条带有拖尾现象，而改良CTAB 法提取的蛇皮果基因组DNA 在质量和数量上均能满足大量PCR 扩增的需要，可以作为优先选用的方法。
图1 蛇皮果不同方法提取的基因组DNA的电泳结果
Fig.1 Pattern of genome DNA by different methods
不同Mg2+ 浓度扩增后的电泳结果见图2，图中11 ～ 15 谱带比M 除外的其它谱带清晰，其对应的Mg2+ 浓度为1.4 mmol/L，即此浓度为蛇皮果基因组DNA 扩增体系中Mg2+ 的最佳浓度。
图3显示dNTPs 浓度在0.12 mmol/L 产生的条带比较清晰，因而此浓度为蛇皮果基因组DNA扩增体系中dNTPs 的最佳浓度。
Taq DNA 聚合酶浓度在0.09 U/μL 时条带已经很清晰（见图4），但引物S2078 在0.12 U/μL 时才扩增出了条带，为了最大限度的扩增出条带将Taq DNA 聚合酶浓度定在0.12 U/μL。
对于PCR 扩增程序中退火温度的调节（见图5），从图中可看到在较大片断（1 500 bp） 的扩增中，6 个温度梯度的清晰度差异并不太大。而扩增出的较小片段中，38 ℃和40 ℃得到的条带更清晰些，取其中间值为39 ℃。
利用上述优化的扩增体系和扩增程序对蛇皮果1 个样品10 个随机引物的扩增表明( 见图6)，多数条带清晰，扩增背景比较干净，扩增片断的大小范围也较大。所以，最终确定蛇皮果RAPD
图2 不同Mg2+ 浓度的蛇皮果基因组DNA 扩增体系扩增的DNA 的电泳谱带
Fig.2 The RAPD PCR results with different concentrations of Mg2+
图3 不同dNTPs 浓度的蛇皮果基因组DNA 扩增体系扩增的DNA 的电泳谱带
Fig.3 The RAPD PCR results with different concentrations of dNTPs
图4 不同Taq DNA 聚合酶浓度的蛇皮果基因组DNA 扩增体系扩增的DNA 的电泳谱带
Fig.4 The RAPD PCR results with different concentrations of Taq DNA polymerase
图5 不同退火温度下蛇皮果基因组DNA 扩增的DNA 的电泳谱带
Fig.5 The RAPD PCR results with different annealing temperature
技术的PCR 扩增体系为15 μL 体系：10×buffer1.5 μL，0.12 mmol/L dNTPs，0.12 U/μL Taq DNA聚合酶，1.4 mmol/L Mg2+，1.0 μmol/L RAPD 引物，12 ng DNA 模板。PCR 扩增程序为：94 ℃预变性2 min；再40 个循环：94 ℃变性30 s，39 ℃退火30 s 和72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸10 min。
目前，对基因组DNA 提取方法研究报道很多，但较难解决的是多糖类物质的去除。由于多糖的许多理化性质与核酸相似，因此用氯仿抽提、选
图6 优化方案对10 个随机引物PCR 的DNA 的电泳谱带
Fig.6 The RAPD PCR results of salak genomic DNA
择性沉淀等常规方法不能有效地去除多糖。由于多糖可以抑制许多酶活性[8]，有多糖污染的DNA样品纯度较低，无法顺利进行PCR 扩增，因此必须尽量避免提取过程中的多糖污染。蛇皮果富含多糖和酚类物质，过多的多糖将影响后期PCR 扩增效果，所以多糖的去除是本实验的关键步骤。本实验首先采用CTAB 法和SDS 法进行基因组DNA 的提取，由于未采取去除多糖的措施，故所得DNA 沉淀为一团胶状物，而且加入1×TE 进行溶解DNA 时需要很长的时间，通过电泳检测可以看出（见图1）受多糖和杂质的影响两种方法跑出的效果都不好，CTAB 法的拖尾现象比较严重，而SDS 法只有一条很模糊的条带。采用CTAB-free法提取的基因组DNA 虽然无拖尾现象而且条带比较清晰，但由于在第一步除多糖的过程中同时也洗去部分的基因组DNA，从而造成基因组DNA量的减少，同时有少量DNA 降解，造成跑出的电泳条带比较分散。改良的CTAB 法首先在缓冲液中加入了β- 巯基乙醇和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP），β- 巯基乙醇能抑制酚类物质的氧化，PVP 作为酚类物质结合剂，可吸附多酚分子上的氢键，形成水不溶性复合物[9]，从而有效的去除蛇皮果当中的酚类物质。同时，PVP 作为澄清剂，具有吸附作用[10]，能吸附多糖将其除去。提高NaCl 浓度是去除多糖的一种有效方法，周诗捷等[11] 对华南五针松成熟针叶提取基因组DNA 时,将NaCl 浓度提高到2 mol/L 并取得较好的提取效果。但在本实验中只有将NaCl 浓度提高到 5 mol/L 时才能有效去除多糖。通过上述分析以及电泳检测结果最终选用改良CTAB 法作为蛇皮果的基因组DNA 提取方法。
通过对蛇皮果RAPD 反应体系优化的研究,有利于建立有效的扩增体系和扩增程序,为蛇皮果分子生物学研究提供技术支持。在扩增体系中,Mg2+ 浓度会影响到酶的活性、合成的忠实性、引物与模板的结合效率和退火温度等方面[12]。从试验设置的4 个浓度梯度来看，随着Mg2+ 浓度的增加，PCR 扩增所产生的条带越来越清晰，而且产生的带型也逐渐的增多。但是，当浓度增加到一定程度时会导致非特异性扩增和引物二聚体的形成。根据电泳检测的结果最终确定了Mg2+ 浓度为1.4 mmol/L。扩增体系中dNTPs 浓度过高会导致Taq DNA 聚合酶错误掺入，而且还会与反应混合液中的Taq DNA 聚合酶竞争Mg2+，抑制酶的活性。所以dNTPs 浓度和Taq DNA 聚合酶浓度需要达到一定的平衡状态。一般RAPD 技术中PCR 扩增的退火温度都在35℃～ 40℃之间[13]，温度过高会抑制PCR 扩增。但是Parasnis[14] 研究番木瓜时使用的退火温度达到45℃，而且李发根等[15] 对棕榈藤研究的退火温度也达到45℃，说明采用RAPD 技术进行分子标记研究时，退火温度范围较大。本实验的退火温度从34℃到44℃设置了6 个梯度，从电泳图中可以看出不同的退火温度之间的差异并不太大，这佐证了RAPD 技术中PCR 扩增程序退火温度适宜范围较广，也证明了RAPD 反应在退火温度上具有较高的稳定性和可重复性。
致谢：中国林业科学研究院热带林业研究所研究员甘四明
博士和硕士生于晓丽对本研究给予建议和实验协助，特此感谢！
中南林业科技大学学报
《中南林业科技大学学报》原名《中南林学院学报》，是中南林业科技大学主办的以林为特色的自然科学学术期刊。该刊1981年创刊，2010变更为月刊，月底出版，国内外公开发行。国际刊号为ISSN 1673-923X，国内刊号为CN43-1470/S。该刊是教育部优秀科技期刊，全国优秀高校学报，湖南省一级期刊。是全国中文核心期刊，中国科学引文数据库来源期刊，中国精品科技期刊，中国科技核心期刊。该刊入编了国内所有的期刊数据库。
主要栏目：林学、生态学、生物科学与技术、植物学、园林、木材科学等。
读者对象：本刊适合于农林院校师生以及农林科研院所、农林管理部门和生产单位的科技和管理人员阅读，也适合于与以上学科和专业有关的其他高校师生和科技人员阅读。
