本研究实验标本松墨天牛 Monochamus alternatus幼虫于 2010年 4月采集于南京紫金山，分别以 75%乙醇常温、无水乙醇 -20°С冷藏和活体 4°С保存 3种方式保存。实验标本墨天牛 M. spp.幼虫（ 2010.03）为 100%乙醇常温固定保存；云杉大墨天牛 M. urussovi幼虫（ 2006.08）、落叶松断眼天牛 Tetropium gabrieli幼虫（ 2009.06）、褐梗天牛 Arhopalus rusticus幼虫（ 2009.05）3种为 75%乙醇常温固定保存。

3种保存方法保存的天牛幼虫标本，每种样品取 3份，采用酚氯仿法、 Takara快速提取试剂盒、 GenMagBio磁珠提取试剂盒 3种方法进行 DNA提取。

酚 -氯仿法 ^[3]：剪取松墨天牛幼虫虫体腹部一段，去除消化道、脂肪、体壁，保留肌肉约 19 mg于 MM400球磨仪中震荡研磨（ 30次 /s）20～ 30 s，后加入 1 mL提取液（10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐， 1 mmol/L乙二胺四乙酸， 1%十二烷基硫酸钠），使蛋白酶 K终浓度达到 10 µg/mL，55℃水浴3～ 5 h。水浴结束后，苯酚 /氯仿 /异戊醇（ v/ v, 25:24:1）抽提 2次，氯仿抽提至无沉淀产生。 2倍体积无水乙醇 -20℃过夜沉淀 DNA，12 000 r/ min 离心 10 min；弃上清，70% 乙醇清洗沉淀 2 次，干燥后溶解于 50 μLTE中。

TaKaRa DNA快速提取试剂盒提取 DNA^[4]：剪取松墨天牛幼虫虫体腹部一段，去除消化道、脂肪、体壁，保留肌肉约 19 mg于 MM400球磨仪中震荡研磨（30次 /s）20～ 30 s，12 000 r/ min 离心 10 min。后续实验采用 TaKaRa DNA提取试剂盒提取 DNA，操作方法根据其使用说明书。

GenMagBio动物细胞组织 /细胞基因组 DNA磁珠提取试剂盒：直接剪取松墨天牛幼虫虫体 19 mg，保留脂肪、体壁、消化道不做任何处理，放于 MM400球磨仪中震荡研磨（ 30次 /s） 20～ 30 s，加入 180 μL Lysis Buffer、20 μL Proteinase K（55℃温浴 3～ 5 h，加入 200 μL Binding Buffer和 200 μL无水乙醇，充分混匀，加入 20 μL磁珠，轻柔颠倒混匀 10 min。离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠， Wash Buffer І （500 μL颠倒混匀 2 min置于磁力架，弃去管内液体，Wash Buffer Ⅱ同样洗涤 2次，离心管仍置于磁力架上，缓慢加入 Wash Buffer Ⅲ， 1 min后移走管内液体。加入 Elution Buffer， 55℃水浴 10 min洗脱磁珠上吸附的 DNA。

1μLDNA稀释 50 倍，在 EPPENDORF 公司生产的生物分光光度计（ Biophotometer6131）下测定波长 260、280 nm 的光吸收值 (OD) 并自动计算 OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值以及相应的质量浓度值。当 OD₂₆₀ /OD₂₈₀的值低于 1.6时，样品中有蛋白质或酚的污染；高于 1.9则说明样品中有 RNA污染。

单轮 PCR引物： J1718，5′- GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC -3′；N2191， 5′-CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC -3′ ^[5]。巢式 PCR使用引物：第一轮， J173：5′-TAA CAG CAC ATG CTT TTG TA-3′；J1331：5′-GGA TAG TCT GAG TAT CGT CG-3′（自行设计）；第二轮， J1718和 N2191。PCR扩增产物经 1.5%琼脂糖电泳分离，可得到 528 bp 左右的扩增片段。

使用 GenMagBio动物细胞组织 /细胞基因组 DNA磁珠提取试剂盒对墨天牛属、落叶松断眼天牛、褐梗天牛及云杉大墨天牛 4个 75%酒精常温保存的幼虫标本进行 DNA提取、巢式 PCR扩增，根据电泳图上此扩增片段的有无判断是否提取到目标 DNA。对目标 DNA纯化测序，测序结果经网上比对，查看是否为目标片段，即线粒体 COI基因 DNA的扩增片段，以对 GenMagBio磁珠试剂盒效果进行验证。

从表1可看出， 75%乙醇常温保存标本用3种方法提取出的 DNA浓度和 OD值都是最低的。活体标本与无水乙醇 -20°С保存的标本使用酚 -氯仿法和 GenMagBio磁珠试剂盒法提取的 DNA OD_260/280值都处于 1.7~1.9之间，属于高质量 DNA，Takara快速提取试剂盒提取的 DNA OD_260/280值高于 1.9，含 RNA污染。从质量浓度的角度看，活体 4°С冰箱保存方法保存的标本 DNA质量浓度最高， 75%乙醇常温保存标本的质量浓度最差，无水乙醇 -20°С保存的标本质量浓度居中。而从 3种提取方式看，同质量样品常规酚 -氯仿法提取出的 DNA量最大， Takara试剂盒最小， GenMagBio磁珠试剂盒居中。尤其是使用 Takara试剂盒提取 75%乙醇常温保存的样品， DNA的浓度与 OD_260/280值都无法测量，可能是标本本身 DNA降解严重且该方法使用过程中 DNA损耗大。实验结果符合文献所述常规酚氯仿法最适于新鲜标本的大量 DNA提取，而现在一般实验室采用的无水乙醇 -20°С保存标本方式， DNA也同样存在降解现象。活体保存虽然实验效果最好，但现在的保存技术还无法做到长时间保存，笔者最长保存松墨天牛幼虫时间为 1～ 2 a。

表1 不同保存和提取方法样品的 DNA浓度与纯度 †
Table 1 The purity and concentration of DNA samples obtained with different extraction and preservation methods

3种方法分别提取 3种保存方式松墨天牛幼虫标本 DNA，对所得 DNA COI保守区域进行 PCR扩增。扩增片段大小为 525 bp。扩增结果如图1所示。

从图1可看出，用酚氯仿法与 Takara试剂盒提取的活体保存松墨天牛 DNA的 PCR扩增结果并不好，酚氯仿只扩增出 1条带， Takara试剂盒法扩增出 2条带且颜色暗淡， GenMag磁珠试剂盒法则 3条带全扩出且亮。通过表1分析，可能是酚氯仿法提取出的 DNA浓度过高不适合直接进行 PCR扩增，应按比例稀释，而 Takara试剂盒法浓度和 OD值都在标准范围，其原因需进一步探讨， GenMag磁珠试剂盒则扩增效果稳定。 3种方法提取无水乙醇 -20度冷藏保存标本 DNA的 PCR扩增产物条带基本全部跑出，条带明显，说明该保存方法保存 DNA可满足进一步分子实验。 3种方法提取 75%乙醇常温保存样品提取出的 DNA都未能在单轮 PCR条件下扩增出条带，说明 DNA确实出现大量降解，导致目标 DNA片段多少，所以将 1b～ 3b 9份 DNA样品进行巢式 PCR。

图1 3种取方法天牛 COI基因单轮 PCR结果电泳检测图谱
Fig.1 Single-PCR amplification results of COI obtained by three methods

图2 75%乙醇常温保存标本巢式 PCR结果电泳检测图谱
Fig.2 Net-PCR amplification results of COI preserved with 75% Alcohol

经过巢式 PCR扩增后 GenmagBio磁珠提取试剂盒提取的松墨天牛幼虫样品扩增出条带，而其它2种方法提取出的 DNA仍未扩增出条带（见图2），说明 GenMagBio磁珠试剂盒因其只吸附 DNA的特性，提取对 DNA降解严重样品提取效果最好，其 OD值过低可能由于 DNA大量断裂成小分子片段引起。为进一步证明此方法获得的结果为实验所要，选取墨天牛属、落叶松断眼天牛、褐梗天牛、云杉大墨天牛实验室 75%酒精常温保存幼虫标本进行巢式 PCR扩增。从图3可看出该方法能提取到目标 DNA。之后对目标 DNA的 PCR产物进行纯化测序，测序结果经 GENBANK上比对，验证其为预期的线粒体 COI基因片段。

图3 d、e、f、g4个样品巢式 PCR结果电泳图
Fig.3 Net-PCR amplification results of four samples (d, e ,f, g)